Recognition & Affinity Extraction
親和性泛指各種化學原子或分子彼此之間產生反應的可能性，也代表兩個化學物質產生的反應趨勢。不同的化學物質通常會根據其電子特性的不同，與各種物質間具有不同強弱的作用力。這些反應性的差異，使化學分子間產生高度專一的辨識性，也造就了自然界、生物體中的各種現象與機制。萃取的分離原理是基於兩溶劑對於化學分子溶解度差異，使其以不同比例分布於兩種溶劑之中。親和性萃取則是將對特定分子具有高度親和性的官能基團建構於溶劑分子本身，因此能夠更精確地根據特定結構，以萃取的方式進行分離。生物分子辨識可定義為受體(receptor)與受質(substrate或ligand)進行選擇性的結合。而具選擇性的原因有幾何構型與非共價鍵吸引兩種，前者為受體與受質兩分子之間在幾何大小及形狀上具有適當的相互辨識位向；後者為兩分子間藉由氫鍵或pi-pi作用力等非共價鍵結合的相互作用力來達到辨識。本實驗室致力於將離子液體設計出更具功能性，來達到親和性萃取或生物分子辨識之能力，開發出相較於傳統方法更快、更高效的專一性純化方法。
(1) 以離子液體促進PCR [1]
在1988年PCR問世後，這項利用嗜熱聚合酶進行DNA片段放大的技術便扮演著舉足輕重的地位。至今，PCR仍密集且頻繁地用於醫學及生物的應用，如基因複製、疾病診斷、法醫鑑識等。GC-rich DNA的複製在生命體中並不困難，但體外實驗中就需藉由其它的技術來克服。我們嘗試著以離子液體（圖一）進行fragment A (266 bp, 80% GC content) 以及B PCR實驗(501 bp; 55% GC content)（from Streptomyces coelicolor）。
圖一：[R-mim][X] (1a–f), [R-dmim][X] (2a–f), [R-3C-im][X] (3a–f), and [R-4C-im][X] (4a–f)。
然而在正常的GC含量的DNA片段中（fragment B，55% GC, 501 bp），離子液體4在DNA放大實驗中有著不錯的表現（圖二、三）。這一些實驗明顯地顯示出離子液體可以非常有效地促進PCR反應。並更促使我們近一步地探究離子液體在PCR反應中是否扮演降低熔點溫度（Tm）的重要角色。圖四清楚地顯示出，再加入4d後Tm值由94.1 oC降至90.5 oC，倘若是以DMSO為促進劑Tm~ 93.9 oC，這些結果也一再地說明離子液體的確可以幫助PCR反應的進行。
圖二：以離子液體(70 mM each)促進normal-GC (55% GC content), 501 bp gene fragment B的放大反應。
圖三：以離子液體4d、DMSO與betaine等促進劑(70 mM)進行GC-rich 266 bp DNA template A 的放大實驗。
圖四：在有SYBR Green I的條件下，以realtime PCR可以量測出Tm值。GC-rich DNA duplexes (PCR product A, 266 bp)含有 4d or DMSO (70 mM each)。
(2) 綠螢光蛋白（Green Fluorescent Protein，GFP）的純化 [2]
本實驗室發表具有分子辨識功能的離子液體，以生物分子親和作用力以及離子液體特殊溶解特性開發一個快速且極有效率的蛋白質純化技術。此研究工作中，我們在分子辨識的基礎上導入離子液體的概念，開發出全新的萃取技術進行蛋白質純化，可大為提高純化的效率與縮短純化操作的時間。GFP因中心的三胜肽（Ser65-Tyr66-Gly67）所組成的螢光團使其可發出綠色螢光，其螢光特性與蛋白質結構有相當大的關係，一旦蛋白質結構被破壞後其螢光特性也隨之消失，由此也可以證明此類離子液體對於蛋白質穩定度的影響。如圖五所示，螢光標示的小分子胜肽可以藉由水相親和性萃取至離子液體相，並可透過競爭是放回水相來達到純化的效果。如圖六，NTA是AIL 1中主要的辨識部位，它的結合原理主要是依靠Ni(II)離子與imiazole的配位結合，由於Ni(II)離子的配位為正八面體（octahedron），扣除與NTA上的三個羧基與氮上孤對電子的配位，Ni離子尚有兩個空軌域可提供His-tag上的兩個imidazole配位，藉此配位可達到與蛋白質結合的目的。
圖五：藉由下層AIL 1進行上層水相中FITC-(His)6-NH2的萃取。(A)為在非螢光下的照片；(B)為在螢光照射下的照片。試管a，缺乏AIL 1的離子液體進行胜肽萃取；試管b，AIL 1缺乏NiCl2的活化進行胜肽萃取；試管c，藉由Ni(II)-活化的AIL 1進行胜肽萃取；試管d，以imidazole進行競爭萃取。
圖六：AIL 1藉由Ni(II)活化後與胜肽形成錯合物
蛋白質萃取的實驗中，E. coli.經表現、破菌、離心後，其上清液直接利用 AIL 1進行活性萃取，藉由簡單的液－液萃取與清洗後，如圖七所示，total cell lysate（lane 2）經由親和力萃取後可以得到極高純度的GFP（lane 4），全部純化可於5分鐘內完成。更重要的是如圖八所示，GFP在離子液體中仍保有螢光特性，這也意味著GFP在離子液體中仍保有原本的結構。
圖七：以親和力萃取純化GFP之SDS-PAGE。
Lane 1, protein weight maker; Lane 2 total cell lysate; Lane 3 , the cell lysate after extraction; Lane 4, purified GFP; Lane 5, GFP
圖八：以AIL進行親和力萃取進行GFP純化。(A)萃取前，GFP存在於水層(上層)，下層為離子液體層。(B) cell lysate經AIL萃取後，GFP則進入下層離子層。
(3) 銅離子的捕捉與胜肽的親和性辨識 [3]
如圖九，本實驗室於2016年所發表的文章也有相似的化學概念，合成具有分子辨識功能的離子液體，來捕捉血清或環境中金屬銅離子的成效，於此文章發表工作中成功地利用AIL2-Cu(II) complex親和性萃取dabsylated His-containing五胜肽醯胺，並達到one-step親和性分離與純化方便且有效的平台。
圖九：(a)和(b)胜肽萃取到離子液體層分別未含有及含有螯合Cu2+，(c) AIL2-Cu(II) complex結構。
(4) 胜肽鏈與蛋白質銨鹽的捕捉與親和性萃取 [4]
如圖十，本實驗室也介紹了一系列冠狀離子液體的發展（1,2,3-triazolium-based, crowned ionic liquids，CILs），特別是客製化的合成針對含有lysine或arginine的胜肽和蛋白質以化學選擇性來達到良好的親和性鍵結。在這個工作中，我們選擇馬骨骼肌的肌紅蛋白（myoglobin of equine skeletal muscle）以及從馬心臟的細胞色素C（cytochrome C from equine heart）作為範例蛋白來試驗CILs分子辨識能力，並透過實驗結果加以證實CIL 6對富含K/R蛋白具有強的親和力。
圖十：冠狀離子液體結構CIL 1-6。
如圖十一所整理的結果顯示，六個CILs在親和性萃取六種N-dabsylated 且含有lysine/K的六肽醯胺能力，發現冠狀離子液體萃取胜肽的效能非常高，依循著離子液體的環大小；也就是說在上層水中CIL 4-6具有化學選擇性的辨識這六個lysine胜肽側鏈ammonium基團，並有效的萃取到下層離子液體層。不論在胜肽中含有lysine基團的數量，CIL 4-6對這六種含有lysine胜肽是具有化學專一性的。如圖十二明確地證明胜肽從水相轉移到離子液體層，完全是藉由CIL 6親和性辨識。然而，利用CIL 2進行萃取時全部的胜肽保留在水中。這兩個結果皆是利用肉眼即可直接觀察到的。此外，值得注意的是，CIL 6離子液體層中的胜肽可以完全地藉由KCl（1 M）競爭萃取回上層水溶液中。
圖十一：疏水性CIL 1-6親和性萃取水層中N-dabsylated lysine/K-containing六肽醯胺。
圖十二：由CIL 2和CIL 6親和性萃取Dab-AKKKKK-NH2胜肽，由KCl競爭CIL 6萃取胜肽從離子液體層到水層。
透過以上簡短的敘述本實驗室所開發出來的離子液體應用於親和性萃取及生物分子辨識的研究上，透過液-液相萃取達到胜肽或蛋白質的純化技術，詳細的發表內容請參閱下方文獻離子液體應用於萃取技術已經純熟，本實驗室也嘗試開發與涉獵新穎的離子液體設計與應用，目前皆有良好的實驗結果，尚待發表。
上述文章更詳細的介紹請參考下方文獻[1-4]，更多有趣的生物分子辨識與親和性萃取文章請參考下方文獻[5-15]。
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